发布日期：2026-10-21 05:45 点击次数：156
微型荧显豁微镜是纪录解放行径啮齿类动物大范围神经行径最弘大、最多功能的用具之一，具有单细胞分辨率。基因编码钙指令剂瞎想的最新说明，使得约略以不访佛的辐射光谱谱线来标记不同的神经元群体。可是开云kaiyun.com，传统微型显微镜仅限于单一激励、单一焦平面成像，这无法赔偿色差，也弗成对两种光谱不同的钙指令剂进行成像。
本文先容了一种开源双通谈微型显微镜，约略同期对遗传学或功能上不同的神经元群体进行成像。色差通过使用电润湿透镜进行矫正，该透镜可达成帧间焦平面的快速切换。为了展示双通谈微型显微镜的性能，筹商东谈主员用红色荧光卵白标记了内侧前额叶皮层中特定层的直爽性神经元或阻抑性中间神经元，并通过绿色基因编码钙指令剂同期纪录了解放行径小鼠不同神经元群体的神经行径。
一、先容
赈济神经收集行径状貌与步履之间的因果相关是神经科学中恒久存在的一个基本问题。为了更深刻地意志神经元群体如何调控不同的步履，愚弄荧光指令剂进行钙成像期间，提供了前所未有的视角，使咱们约略在数周全数月的时候要领上，不雅察成百上千个神经元的单细胞行径。连年来，荧显豁微镜的袖珍化极大拓展了钙成像期间所能应用的步履范式范围，从学习与顾虑到复杂步履，如社会交互、懦弱条目反射以及操作性步履。
张开剩余93%微型荧显豁微镜畛域的最新说明包括：使用双LED微型显微镜达成同步成像与光遗传学操控，以及在生意和学术系统中正在被建议的初步版块双色微型显微镜。
为双色成像或同步成像与光遗传操控提供多光源的一种方法，是通过光纤将外部光源与微型显微镜耦合。可是，这种方法无法惩处使用梯度折射率透镜成像时的色差问题，而况可能死亡动物的行径解放度。
本文建议一种双色微型显微镜版块，约略通过在轮流帧中切换光源和焦平面来赔偿色差。
二、材料与方法
01.微型显微镜
微型显微镜的瞎想包含一个带有可调谐透镜的双LED单光子荧显豁微镜，采纳Solidworks软件瞎想，并使用玄色树脂材料3D打印而成。该瞎想引入了两个独处的、光谱不同的光源，波长诀别为470纳米和565纳米。微型显微镜的瞎想展示于图1A，无缺组件清单列于表1。一块定制印刷电路板承载了CMOS图像传感器，该传感器与LED同步，并将数据流传输至一块定制的现场可编程门阵列适度板。
图1. （A）微型显微镜瞎想图（部件清单对应表1）。（B）左图：1951 USAF分辨率测试标板的图像。右图：诀别对应左图中蓝色和红色高亮所示的列与行的像素强度值，展示了组7元素6，对应4.4毫米分辨率及约3.3倍放大率。（C）微型显微镜LED及滤光片的光谱图。（D）图表清楚了轮流通谈建树下微型显微镜信号的时序，在此建树下生成两个交错的视频流。比例尺为100毫秒，反应了具有代表性的10帧/秒的图像传感器帧率。（E）在单通谈纪录和双色轮流建树下，对45度景深标靶成像期间，不同测试纪录所取得的焦平面深度图。焦平面深度是凭据电润湿透镜适度信号，基于图F所示的拟合线性模子筹商得出。（F）在单通谈纪录和双色轮流建树下，对不同焦深下拍摄的45度景深标靶中15线对/毫米垂直线所对应的平均帧进行列平均后的成果。
表1. 材料清单。
统统执行要领均取得怀俄明大学及好意思国国度药物销耗筹商所动物保护与使用委员会的批准，并依照好意思国国立卫生筹商院的指挥目的进行。执行使用的Gad2-IRES-Cre雄性和雌性繁衍鼠购自杰克逊执行室。Tardbp flox/flox 及 CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F 雄性和雌性繁衍鼠由约翰斯·霍普金斯大学医学院筹商东谈主员执行室提供。这些小鼠品系在怀俄明大学繁育和饲养。小鼠饲养于12小时光暗轮回条目下，每笼最多五只，解放获取食品和水。
香港星云先进期间有限公司（NAT）是Grintech亚洲代理商，咱们为客户提供梯度折射率透镜（GRIN透镜）等光学居品。
02.立体定位打针
凭据已发表的决议，对9至11月龄的TardbpF/F雄性和雌性小鼠进行内侧前额叶皮层区域的双侧病毒打针。小鼠麻醉后固定于立体定位仪，通过加热垫保管体温在35°C。使用牙科钻在颅骨上钻孔，通过微量打针泵适度的微升打针器，以500纳升/分钟的流速，在指定坐标处双侧各打针500纳升病毒。左侧内侧前额叶皮层打针AAVretro-hSyn-mCherry，右侧打针经1:2稀释的AAV1-CaMKII-GCaMP6f。术后3天，小鼠饮用水中添加布洛芬，并复原14天。
对12至13月龄的Gad2-IRES-Cre小鼠进行右侧内侧前额叶皮层的连气儿两次病毒打针标记。初次打针1:2稀释的AAV1-hSyn-GCaMP6f，以绿色荧光钙指令剂标记统统神经元。复原14天后，在归并区域进行第二次病毒打针，使用AAV1-CAG-DIO-NLS-tdTomato，以tdTomato标记GABA能神经元。
对3至5月龄的CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠进行单侧打针，使用AAV1-CaMKII-GCaMP6f和AAV1-CAG-DIO-NLS-tdTomato的1:1夹杂病毒，使得GCaMP6f标记统统锥体神经元，而tdTomato标记统统抒发Cre的细胞。tdTomato的抒发需在他莫昔芬指挥Cre重组酶活性后才会发生。
03.梯度折射率透镜植入
按照已发表的执行室决议，在右侧内侧前额叶皮层区域植入梯度折射率透镜。小鼠使用氯胺酮/甲苯噻嗪夹杂麻醉，并在手术部位备皮。固定小鼠头部后，切除三角形皮肤区域，剩余皮肤用氰基丙烯酸酯粘附于颅骨。使用钻头在相关于前囟的指定坐标处钻孔。通过畅达真空系统的27G钝头针，将脑组织逐层吸除至1.8毫米深度，同期握续提防用95%氧气和5%二氧化碳均衡的东谈主工脑脊液。计帐创腔后，将直径1毫米的梯度折射率透镜植入，并用两层牙科水泥固定，终末盖上定制保护帽。术后3天饮水中添加布洛芬，复原一个月。
04.底座装配
使用异氟烷麻醉小鼠并固定于立体定位仪。将装有底座的双色微型显微镜通过定制的电动适度器出动至透镜隔壁，使显微镜聚焦于透镜内的视线。通过两轮牙科水泥应用将底座固定。待水泥凝固后，移走显微镜主体，并用与底座匹配的保护帽袒护透镜。
05.重复体内钙成像
在钙成像执行日，用异氟烷少顷麻醉小鼠。将双色微型显微镜固定于底座上，让小鼠从麻醉中复原30分钟。纪录期间，让小鼠在方形开朗时势中解放探索15分钟。使用定制的钙成像软件NeuView纪录钙图像。通过最大化检测到的神经元数目笃定最好焦平面，并将LED功率设定在饱胀低以幸免因峰值行径荧光导致图像传感器像素饱和。关于双色纪录，LED1用于捕捉代表GCaMP6f波动的绿色通谈，LED2用于捕捉静态的红色信号。小鼠在开朗区域的步履通过步履纪录软件纪录。每只小鼠的绿色通谈纪录以每秒10帧的帧率进行，每次纪录时长3.5分钟。红色通谈纪录则在多个焦平面进行，通过改动可调透镜的脉冲宽度调制适度信号，每个平面麇集约100帧。钙成像和步履纪录以每周一次的休止重复进行4至5个月。通过参考之前的钙成像纪录，鼎新脉冲宽度调制适度信号及X和Y偏移，确保归并小鼠在屡次纪录中视线保握一致。
关于CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠，在他莫昔芬指挥前进行三次体内钙成像纪录行为神经元基线。随后，用含有他莫昔芬的饲料喂养约18至21天以指挥Cre重组酶依赖的tdTomato抒发。之后，每周对这些小鼠进行一次开朗时势测试中的重复体内钙成像纪录。
06.神经数据分析
来自微型显微镜CMOS传感器的每一帧图像均通过3×3中值滤波器处理，并使用基于傅里叶变换的定制图像配准方法进行畅通矫正，以赔偿显微镜畅通引起的X-Y偏移。关于包含GCaMP6f动态信号的绿色通谈，使用基于拘谨非负矩阵理解的方法CaImAn索求每次纪录的神经元抽象和行径轨迹。关于每次由3次纪录组成的执行单位，对神经元进行配准，并通过平均每次检测到的神经元抽象来创建单位神经元图谱。该图谱用于通过基于感兴味区域的方法，估算在未被CaImAn检测到的纪录中神经元的行径。
关于捕捉tdTomato抒发神经元静态荧光的红色通谈，对每个焦平面纪录的平均图像进行高通滤波和分割，以识别tdTomato标记神经元的胞体。
在对每个执行单位的两个通谈的平均图像进行配准后，基于其抽象至少50%的访佛度来匹配单个神经元。
07.焦平面估算
为了评估电润湿透镜适度信号变化对使用45度景深靶标测得的焦平面深度的影响，咱们筹商了每个焦深下100帧纪录的平均帧的列平均像素值，这反应了沿X轴检测到的15线对/毫米垂直线。所得弧线近似为截断至一次谐波的傅里叶级数，并乘以指数包络弧线，其中中心参数b示意估算的焦平面深度。
基于每个适度信号脉冲宽度调制对应的估算焦深，筹商东谈主员拟合了一个线性模子来近似形容适度信号占空比与最终焦平面深度之间的相关。
三、成果
在1951 USAF分辨率测试标板上测试了微型显微镜的分辨率后，筹商东谈主员在45度景深靶标上测量了焦深范围。由于双色微型显微镜的应用之一是通过在每帧轮流光源和焦平面深度来同期纪录两种光谱不同的指令剂，因此筹商东谈主员量化并比拟了单通谈和双通谈成像的焦深能力。
领先，筹商东谈主员从绿色通谈麇集了100帧的测试数据，每次测试在不同的焦深下进行，袒护了电润湿透镜统统可能的适度信号范围，共进行了24次测试。接着，基于每次测试平均帧的列平均像素值的拟合包络线中心，估算每次测试的焦平面深度，该中心代表45度景深靶标上聚焦的15线对/毫米垂直线的中心。
为诠释在轮流双色成像中达成了无缺的焦平面切换，筹商东谈主员以类似方法估算了每个通谈的焦平面深度，共进行了20次测试，并冉冉增大两个通谈焦平面之间的互异。通过比拟每个电润湿透镜适度信号对应的估算焦平面的线性拟合成果，不雅察到单通谈绿色、双通谈绿色和双通谈红色的拟合斜率相通，标明在单通谈和双通谈交错状貌下，对电润湿透镜适度信号的响应是相通的。
随后，筹商东谈主员使用一个直径为1毫米的Grintech梯度折射率透镜，在25毫米网格测试玻片上测试了微型显微镜，测量到了主要由梯度折射率透镜引入的合理水平的畸变。通过在Z轴宗旨以9.6微米为步长改动电润湿透镜的焦平面，筹商东谈主员在36个不同的轴向平面对靶标进行了成像。通过检测每条线交叉点的最好焦平面，并通过线性讲究估算出佩茨瓦尔曲率半径为343.1毫米。
图2.（A）一个标定用的25毫米网格靶标玻片图像，其上叠加了等间距的25毫米线交叉点，这些点与成像交叉点高度吻合。焦深0被界说为最多交叉点处于焦点平面的位置。（B）等间距25毫米线交叉点与本色显微镜视线中检测到的交叉点的叠加对比图。（C）系统畸变的测量成果。（D）佩茨瓦尔场曲率的测量：筹商每个线交叉点的最好焦平面，并通过线性讲究估算拟合球面的半径和中心。（E）一个含有15微米直径荧光微珠的测试玻片在绿色通谈和红色通谈的样本图像：已识别出的微珠相等峰值亮度位置被高亮并编号清楚。（F）图E所示测试玻片在针对7号微珠的最好焦深下，绿色通谈与红色通谈的图像，展示了该代表性微珠在X-Y坐标位置上的X-Y、X-Z和Y-Z平面视图。图像的焦深在X-Z和Y-Z平面上用蓝色实线标出。（G）在绿色通谈和红色通谈检测到的每个15微米荧光微珠在X-Y平面以及三维空间中的峰值位置。（H）15微米荧光微珠在绿色通谈与红色通谈之间于X、Y、Z方进取的焦平面互异。（I）一个含有4微米直径荧光微珠的测试玻片在绿色通谈的样本图像。（J）在绿色通谈和红色通谈检测到的每个4微米荧光微珠在X-Y平面以及三维空间中的峰值位置。（K）4微米荧光微珠在绿色通谈与红色通谈之间于X、Y、Z方进取的焦平面互异。
此外，筹商东谈主员还在直径为15微米和4微米的荧光微珠上测试了微型显微镜的性能。测量成果清楚，横向色差有限，但轴向色差较为显耀。为了矫正轴向色差，可能需要通过适度电润湿透镜来鼎新焦平面。
随后，筹商东谈主员通过体内成像测试了微型显微镜在内侧前额叶皮层中的应用，该测试是在数月内每周一次的开朗时势执行中进行的。筹商东谈主员使用了两种光谱不同的指令剂来标记不同的神经元群体：在每次开朗时势执行初始前，仅翻开565纳米LED，在5个不同的焦平面上纪录100帧，以识别被tdTomato标记的神经元。
愚弄电润湿透镜约略握续透露鼎新焦平面的能力，筹商东谈主员达成了对神经元长达5个月的跟踪。在归并天的成像执行中，翻开470纳米LED，进行了3.5分钟的开朗时势执行纪录，捕捉了解放探索期间抒发GCaMP的神经元的行径。这种方法使得筹商东谈主员约略凭据两个通谈的访佛情况识别特定的神经元亚群，并恒久跟踪不同神经元群体的行径。
图3.（A）在参考焦深D0（底座装配时设定）基础上，第35天和第112天，于5个不同焦深下纪录的红色通谈像素值（仅使用565纳米LED）的磨砺平均负像。每个焦深检测到的神经元图谱叠加清楚（第35天为绿色，第112天为蓝色）。（B）第35天（绿色）与第112天（紫色）在中间焦深下纪录的神经元图谱对比。
行为主张考证执行，筹商东谈主员领先使用tdTomato标记了Gad2-IRES-Cre小鼠的阻抑性神经元，并同期通过GCaMP6f监测了内侧前额叶皮层中阻抑性与直爽性神经元的神经行径。筹商东谈主员还使用tdTomato标记了他莫昔芬指挥型CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠内侧前额叶皮层中的大无数直爽性神经元，或采纳逆行标记法用tdTomato特异性标记了第三层的直爽性神经元。通过纪录GCaMP6f的神经行径，筹商东谈主员比拟了两种情况下红绿通谈访佛神经元的比例。愚弄每个执行单位中两个视频流生成的神经元抽象访佛情况，来匹配两个通谈中识别出的神经元。成果安妥预期：在CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠中，每个执行单位红绿通谈神经元的访佛比例均高于逆行标记的第三层锥体神经元。
图4.（A）一只Gad2-IRES-Cre小鼠在归并天的红色通谈纪录的磨砺平均像素值，以及绿色通谈纪录的像素法式差。该小鼠的阻抑性神经元被AAV-CAG-DIO-NLS-tdTomato标记，统统神经元则被AAV-hSyn-GCaMP6f标记。图中清楚了各通谈检测到的神经元抽象，其中两个通谈匹配的神经元用绿色高亮标出（深绿色代表GCaMP标记的神经元，浅绿色代表tdTomato标记的神经元）。（B）左图：红色通谈与绿色通谈识别出的神经元图谱叠加；右图：神经元图谱中单色高亮的代表性神经元的钙行径轨迹：蓝色轨迹属于仅在绿色通谈检测到的神经元，绿色轨迹则属于在两个通谈均检测到的神经元（深绿色代表GCaMP标记的神经元，浅绿色代表tdTomato标记的神经元）。
图5.（A）空间漫衍图清楚了两唯有代表性小鼠的红色通谈平均帧及检测到的tdTomato神经元抽象，绿色通谈的帧峰值信噪等到检测到的GCaMP神经元抽象，以及红绿通谈神经元抽象的叠加。仅在红色通谈检测到的神经元抽象清楚为红色，仅在绿色通谈检测到的神经元抽象清楚为蓝色，两个通谈均匹配的神经元用实线抽象示意。插图清楚了各通谈检测到的神经元数目相等访佛情况。（B）条形图展示了不同小鼠中两个通谈匹配的神经元百分比。蓝色条形代表使用AAV1-CAG-DIO-NLS-tdTomato和AAV1-CaMKII-GCaMP6f标记大无数直爽性神经元的CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠的数据；绿色条形代表使用AAVretro-hSyn-mCherry逆行标记第三层锥体神经元的数据。
四、参谋
在此，咱们先容了一款具备可变焦能力的双通谈微型显微镜，可用于对不同神经元群体进行成像。该开源瞎想上风之一在于可使用老本相对较低的3D打印部件和通用组件构建。另一个优点是该瞎想具有高度可定制性，可凭据具体需乞降执行要求进行修改。举例，通过更换滤光片和光源，可将其功能拓展至不同的指令剂，或加多光遗传学功能，以达成对特定神经元群体行径的同步监测与调控。
咱们通过在数月内对小鼠内侧前额叶皮层中两种遗传学特质不同的神经元群体进行开朗时势测试的体内成像，考证了该微型显微镜的功能。当仅依赖活跃神经元的空间漫衍时，跳跃数周乃至数月的图像配准可能面对挑战，因为即使在相通步履下，活跃的神经元组合也可能随时候变化。为擢升恒久成像数据集的配准精度，并克服焦平面漂移和脑结构变化对恒久神经元跟踪的死亡，双色微型显微镜可采纳一种建树决议：一个通谈有益测量神经元行径，另一个通谈则静态标记神经元并生成透露的神经元图谱，从而为被跟踪神经元提供更精确的配准基础。
关于需要纪录抒发不同基因编码钙指令剂的两个神经元群体行径的筹商，双色微型显微镜可通过在轮流帧中切换光源和焦平面来达成。这收获于电润湿透镜的切换时候在毫秒量级，快于钙能源学的变化时候及钙成像的典型帧率。可是，在此状貌下，每个通谈的帧率会减半，导致采样频率缩短，可能不及以筹商发生在更快时候要领上的神经经由或步履。反之，关于更高帧率成像及响应更快的指令剂，举例电压敏锐染料成像，电润湿透镜的切换时候可能成为影响成分，需要在成像系统瞎想中赐与审慎讨论。
香港星云先进期间有限公司（NAT）是Grintech亚洲代理商，采购梯度折射率透镜（GRIN透镜）等光学居品请立即有关咱们。
发布于：河南省